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    qPCR熒光定量

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    詳細介紹
    品牌其他品牌貨號Q711-02
    規格500rxn供貨周期現貨
    主要用途實(shí)時(shí)熒光定量應用領(lǐng)域醫療衛生,環(huán)保,化工,生物產(chǎn)業(yè),農業(yè)

      qPCR熒光定量是指在反應體系中加入熒光基因,利用熒光信號積累實(shí)時(shí)監測整個(gè)PCR進(jìn)程,后通過(guò)標準曲線(xiàn)對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。

      qPCR熒光定量技術(shù)不僅實(shí)現了PCR從定性到定量的飛躍,而且與常規PCR相比,具有特異性更強、靈敏度高、重復性好、定量準確、速度快、全封閉反應、有效解決PCR污染問(wèn)題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn),已成為*的核酸分子定量的標準方法,目前在基因表達研究和臨床疾病檢測等領(lǐng)域已得到廣泛應用(如轉基因動(dòng)植物檢測、RNAi基因失活率檢測、病原微生物或病毒含量檢測、基因差異表達、基因分型)。

    AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix

    圖1.廣闊的定量閾

    以HeLa 細胞cDNA 為稀釋液,將pUC19 質(zhì)粒進(jìn)行7 個(gè)10 倍梯度稀釋?zhuān)? 個(gè)稀釋梯度中質(zhì)??截悢禎舛燃s為7 copies/4 μl。使用AceQ® Universal 預混液對各稀釋梯度中的pUC19 質(zhì)粒進(jìn)行檢測,每孔模板使用量為4 μl??梢钥吹?,AceQ®Universal預混液在寬廣的模板量區間內具有線(xiàn)性關(guān)系,可輕松檢測出個(gè)位數拷貝的待測模板。

    圖2.產(chǎn)品的特異性

    對隨機選取的38 個(gè)體系進(jìn)行qPCR 檢測,驗證AceQ® Universal預混液擴增特異性。通過(guò)對融解曲線(xiàn)分析可知,38 個(gè)體系均無(wú)非特異性擴增。說(shuō)明AceQ® Universal 預混液擁有的特異性。

    圖3.全平臺通用

    使用AceQ® Universal 預混液在不同類(lèi)型的qPCR 儀(機型:StepOnePlusTM、QuantStudioTM 3、LightCycler® 96)上擴增GAPDH 基因,定量結果很好。說(shuō)明AceQ® Universal 預混液儀器適用性廣,無(wú)需針對不同儀器調整ROX 濃度。

    本產(chǎn)品是使用SYBR Green I 嵌合熒光法進(jìn)行qPCR的試劑,采用化學(xué)法修飾的熱啟動(dòng)DNA聚合酶AceTaq® DNA Polymerase,配合針對qPCR優(yōu)化的適Buffer,可以有效抑制非特異擴增,從而顯著(zhù)提高擴增效率,適用于進(jìn)行高靈敏度的qPCR反應。本產(chǎn)品是一種含有qPCR反應適濃度SYBR Green I的2 × 預混試劑,可以在寬廣的定量區域內得到良好的標準曲線(xiàn),對靶基因進(jìn)行準確定量、檢測,重復性好,可信度高。另外,產(chǎn)品中含有特殊的ROX Passive Reference Dye,適應于所有qPCR儀器,無(wú)需在不同儀器上調整ROX的濃度,只需在配制反應體系時(shí)加入引物和模板即可進(jìn)行擴增。


    Q1:如何判斷CT值有效性?

    A1:(1) 融解曲線(xiàn)單峰(染料法)

    (2) 擴增曲線(xiàn)指數擴增區域,復孔間CT值STD<0.2

    (3) 閾值設置合理

    (4) NTC確認無(wú)氣溶膠污染或可以忽略

    (5) NRT確認無(wú)基因組殘留污染或可以忽略

    (6) 擴增效率符合近似計算標準,標準曲線(xiàn)相關(guān)系數R2大于0.98,擴增效率e介于95-105%或者90-120%之間。

    Q2:常見(jiàn)的擴增曲線(xiàn)異常有哪些,如何解決?

    A2:(1) 擴增曲線(xiàn)不光滑:信號太弱,經(jīng)系統矯正后產(chǎn)生。建議提高模板濃度重復實(shí)驗。

    (2) 擴增曲線(xiàn)斷裂或下滑:一般由于模板濃度較高,基線(xiàn)的終點(diǎn)值大于CT值。建議減小基線(xiàn)終點(diǎn)(CT值-4),重新分析數據。

    (3) 個(gè)別擴增曲線(xiàn)突然驟降:反應管內留有氣泡,由于溫度升高后氣泡破裂,使儀器檢測到的熒光值突然降低所致。建議反應前要仔細檢查反應管內是否有氣泡殘留。

    (4) 擴增曲線(xiàn)呈鋸齒狀且不連續:ROX添加不當。需校正參比染料。

    Q3:標準曲線(xiàn)擴增效率小于90%或者大于120%,線(xiàn)性關(guān)系不佳。

    A3:(1) 加樣誤差。加大模板稀釋倍數,提高加樣體積。加大稀釋體積,使不同稀釋梯度的濃度更準確。

    (2) 標準品降解。重新制備標準品,重復實(shí)驗。

    (3) 模板濃度過(guò)高。存在反應抑制,增加模板稀釋倍數。

    (4) 引物擴增特異性不好。重新設計引物,重復實(shí)驗。

    Q4:在定量時(shí),如何判斷cDNA投入量。

    A4:*得到的cDNA需要進(jìn)行多個(gè)梯度稀釋?zhuān)瑢⒉煌荻认♂尩腸DNA進(jìn)行qPCR定量,選取CT值落在18-28,或者15-33范圍內的擴增曲線(xiàn)對應的cDNA 稀釋梯度作為后續該基因的參考稀釋度(CT值在18-28,或者15-33區間范圍被認為是準確的)。有一點(diǎn)需要注意,當使用cDNA原液進(jìn)行檢測的時(shí)候,使用量不能超過(guò) qPCR體系的1/10,因為cDNA中包含很多抑制qPCR的組份,使用體積過(guò)大會(huì )導致擴增失敗。

    Q5:如何確定基因表達量高低。

    A5:如果基因擴增CT值超過(guò)30,使用PCR產(chǎn)物通過(guò)梯度稀釋創(chuàng )建標準曲線(xiàn),判斷該引物擴增效率,若擴增效率滿(mǎn)足90-120%,則可以判斷該基因擴增CT值偏大是由于基因表達量低所致。

    Q6:陰性對照出現明顯擴增。

    A6:(1) 反應體系污染。更換新的Mix、水、引物重復實(shí)驗。反應體系在超凈工作臺內配制,減少氣溶膠污染。

    (2) 擴增為引物二聚體引起。配合融解曲線(xiàn)進(jìn)行分析。

    Q7:NRT出現明顯擴增。

    A7:NRT出現明顯擴增,說(shuō)明存在基因組污染,可通過(guò)實(shí)驗組和NRT的CT值來(lái)判斷實(shí)驗數據是否可用。當實(shí)驗組CT值與NRT的CT值差值大于5,說(shuō)明由gDNA導致的誤差小于5%,則可以忽略gDNA污染;若實(shí)驗組與NRT的CT值差值小于3或者幾乎一致,則實(shí)驗組擴增產(chǎn)物的模板很大一部分來(lái)源于gDNA,這樣的實(shí)驗組就失去定量意義,建議使用去基因組的RNA提取試劑盒進(jìn)行RNA提取,或者反轉錄時(shí),加入去基因組步驟。

    Q8:CT值出現太晚。

    A8:(1) 擴增效率極低。優(yōu)化反應條件,嘗試三步法擴增程序,或者重新設計合成引物。

    (2) 模板濃度太低。減少稀釋度重復實(shí)驗,一般未知濃度的樣品先從Zui高濃度做起。

    (3) 模板降解。重新制備模板,重復實(shí)驗。

    (4) PCR產(chǎn)物太長(cháng)。推薦PCR產(chǎn)物長(cháng)度為80 bp-150 bp。

    (5) 體系中存在PCR抑制劑。一般為模板帶入,加大模板稀釋倍數或者重新制備模板重復實(shí)驗。

    Q9:反應結束無(wú)擴增曲線(xiàn)出現。

    A9:(1) 反應循環(huán)數不夠。一般設置循環(huán)數為40,但需要注意的是過(guò)多的循環(huán)會(huì )增加過(guò)多的背景信號,降低數據可信度。

    (2) 確認程序中是否設置了信號采集步驟。兩部法擴增程序一般將信號采集設置在退火延伸階段;三步法擴增程序應當將信號采集設置在72℃延伸階段。

    (3) 確認引物是否降解。長(cháng)時(shí)間未使用的引物應先通過(guò)PAGE電泳檢測完整性,以排除引物降解的可能性。

    (4) 模板濃度太低。減少稀釋度重復實(shí)驗,一般未知濃度的樣品先從Zui高濃度做起。

    (5) 模板降解。重新制備模板,重復實(shí)驗。

    Q10:融解曲線(xiàn)出現多峰。

    A10:(1) 引物設計不優(yōu)。根據qPCR設計原則設計、合成新的引物。

    (2) 引物濃度太高。適當降低引物濃度。

    (3) cDNA模板帶有基因組污染。重新制備cDNA模板。

    Q11:實(shí)驗重復性差。

    A11:(1) 加樣體積失準。使用準確度較好的移液槍?zhuān)瑪U大反應體積,將模板做高倍稀釋?zhuān)源篌w積加入反應體系中。

    (2) 定量PCR儀不同位置溫度控制不一致。定期校準儀器。

    (3) 模板濃度太低。模板濃度越稀,重復性越差,減少模板稀釋度或提高加樣體積。

    (4) 做4-6個(gè)復孔,刪除其中重復性不好的孔,將剩余的進(jìn)行后續計算。

    Q12:高GC含量的模板,建議用什么產(chǎn)品進(jìn)行定量?

    A12:建議用Q111進(jìn)行定量。

    Q13:如果內參CT值很低,目標基因CT值很高,該如何稀釋樣品?

    A13:可以在定量?jì)葏⒌臅r(shí)候將模板稀釋?zhuān)磕康幕驎r(shí)模板不稀釋?zhuān)Y果仍舊采用 2-ΔΔCT進(jìn)行計算,CT值減兩次,稀釋倍數會(huì )被相應減掉,但要保證不同樣品在檢測同一基因時(shí)稀釋倍數要一致。

    Q14:如何預防氣溶膠污染?

    A14:在加樣的時(shí)候要小心操作,盡量在超凈工作臺中進(jìn)行加樣,并注意通風(fēng)。擴增反應結束后,盡量不要打開(kāi)產(chǎn)物的管蓋,不要跑膠,跑完后需要妥善處理。如果氣溶膠污染情況很?chē)乐?,建議采用通風(fēng)結合含強氧化劑的消毒液進(jìn)行處理。

    Q15:相對定量為什么要做標準曲線(xiàn)?

    A15:相對定量分析中采用2-ΔΔCT公式進(jìn)行計算比較不同樣品中基因的表達量時(shí),前提是該體系的擴增效率e是盡可能接100%的。相對定量中做標準曲線(xiàn)的目的就是為了判斷該擴增體系中的擴增效率e是否是接近100%,能否用2-ΔΔCT公式進(jìn)行計算;如果擴增效率e與100%相差很大,在比較基因表達差異時(shí)是需要帶入實(shí)際的擴增效率進(jìn)行計算的。

    Q16:怎么做定量?

    A16:首先需要有一個(gè)已知拷貝數濃度的樣品作為標準品,將其稀釋至少5個(gè)梯度后和待測樣品同時(shí)上機進(jìn)行定量檢測,以標準品拷貝數的Log值為橫坐標,以標準品的CT值為縱坐標繪制標準曲線(xiàn)方程,將檢測獲得的待測樣品的CT值帶入標準曲線(xiàn)方程中就能求得待測樣品的拷貝數濃度。

    Q17:模板的稀釋液選擇。

    A17:稀釋模板可以使用購買(mǎi)的Nuclease-free water、DEPC水或者實(shí)驗室自備的ddH2O等。TE里有EDTA會(huì )抑制酶的活性,不可作為稀釋液。


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